Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)系統(tǒng)是控制哺乳動物細(xì)胞中目的基因定時表達(dá)的強(qiáng)大工具。Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)載體作用：當(dāng)不存在四環(huán)素及其類似物（如doxycycline）的情況下，目的基因幾乎或完全沉默；當(dāng)往體系中添加四環(huán)素或其他類似物（如doxycycline）時，目的基因得到快速高水平表達(dá)。四環(huán)素不存在的情況下時，衍生于TeR（Tet抑制蛋白）和KRAB-AB（Kid-1蛋白轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域）的融合蛋白tTS結(jié)合TRE啟動子，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制。另一方面，四環(huán)素存在時，衍生于突變型Ter抑制蛋白和VP16蛋白（轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域）的融合蛋白rtTA結(jié)合TRE啟動子，激活基因轉(zhuǎn)錄。

除了以tTS和rtTA融合蛋白作為基因轉(zhuǎn)錄激活的開關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)Tet-On載體系統(tǒng)，我們還提供專門為組織特異表達(dá)設(shè)計低泄露型（Low leak）Tet-On載體系統(tǒng)。這種實(shí)驗(yàn)通常要求在靶組織處四環(huán)素存在，而非靶組織處無四環(huán)素作用。該載體上存在三個表達(dá)盒：1. TRE啟動子驅(qū)動的GOI表達(dá)；2. 通用啟動子驅(qū)動的tTS基因表達(dá)；3. 用戶自定義啟動子驅(qū)動的rtTA基因表達(dá)。當(dāng)四環(huán)素不存在時，通用啟動子驅(qū)動tTS在所有組織中表達(dá)。tTS結(jié)合TRE啟動子，導(dǎo)致GOI在所有組織中的轉(zhuǎn)錄抑制。四環(huán)素存在時，rtTA被在靶組織被轉(zhuǎn)錄并結(jié)合TRE啟動子，從而激活GOI在靶組織中表達(dá)。

常規(guī)Tet-On質(zhì)粒載體可以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入多種多樣的哺乳動物細(xì)胞。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用常規(guī)轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)到哺乳動物細(xì)胞中是使用最廣泛的方法。雖然近年來開發(fā)了不少更為先進(jìn)的基因?qū)胼d體系統(tǒng)（如慢病毒載體、腺病毒載體、AAV載體和piggyBac等），但常規(guī)質(zhì)粒基因表達(dá)載體仍被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用，這主要得益于其在技術(shù)上的簡便性以及在各種類型細(xì)胞中的高效轉(zhuǎn)染率。常規(guī)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵特點(diǎn)是短暫性，并且在宿主基因組中的整合效率非常低（通常小于1%）。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的Tet-On誘導(dǎo)型基因表達(dá)載體旨在—當(dāng)缺乏四環(huán)素時，實(shí)現(xiàn)目的基因的幾乎或完全沉默；當(dāng)往體系中添加四環(huán)素時，目的基因得到快速高水平表達(dá)。Low leak型Tet-On載體系統(tǒng)是一種改進(jìn)版本，可以讓目的基因在四環(huán)素存在的情況下于靶組織特異表達(dá)，而在非靶組織減少其表達(dá)至極低水平。我們的載體系統(tǒng)已經(jīng)過優(yōu)化，其在大腸桿菌中具有高拷貝復(fù)制能力，且對細(xì)胞具有高效轉(zhuǎn)染率。

類似開關(guān)的嚴(yán)格基因表達(dá)調(diào)控：只依賴rtTA的Tet-on系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)劑的情況下，會有明顯的泄露表達(dá)。我們的Tet-On基因表達(dá)載體可嚴(yán)格調(diào)控基因的表達(dá)，在沒有誘導(dǎo)劑的情況下可將背景泄露表達(dá)最小化，并保持該系統(tǒng)對四環(huán)素誘導(dǎo)的高靈敏度。

在非靶組織最小化泄露表達(dá)：我們的Low leak版本Tet-On載體系統(tǒng)整合有CBh啟動子驅(qū)動tTS表達(dá)。無四環(huán)素作用時，非靶組織區(qū)域的tTS結(jié)合TRE啟動子，抑制了目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

載體容量非常大：我們的載體總?cè)萘靠蛇_(dá)30 kb，其中質(zhì)粒骨架和Tet-On元件只占5.2kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

高水平表達(dá)：TRE啟動子可驅(qū)動目標(biāo)基因在誘導(dǎo)狀態(tài)下高水平表達(dá)。 另外，常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)（每個細(xì)胞多達(dá)幾千拷貝），使外源基因能高水平表達(dá)。

載體DNA非整合型：常規(guī)質(zhì)粒在細(xì)胞里主要以游離DNA狀態(tài)存在，所以常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染也稱為瞬時轉(zhuǎn)染。然而，質(zhì)粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因組中（質(zhì)粒轉(zhuǎn)染每10²~10⁶個細(xì)胞可能會有一個細(xì)胞的基因組被整合，整合效率取決于細(xì)胞類型）。如果將攜帶了藥物抗性基因或者熒光標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞中，在經(jīng)過擴(kuò)大和傳代培養(yǎng)后，可以使用藥物篩選或細(xì)胞分選來獲得穩(wěn)定整合了該載體的細(xì)胞。

可轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型受限：不同類型細(xì)胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率差異很大。非分裂細(xì)胞比分裂細(xì)胞更難轉(zhuǎn)染，原代細(xì)胞比永生化細(xì)胞系更難轉(zhuǎn)染。一些重要的細(xì)胞類型更是難以轉(zhuǎn)染，如神經(jīng)元和胰島β細(xì)胞。另外，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，很少運(yùn)用到活體實(shí)驗(yàn)。

基因拷貝數(shù)在不同細(xì)胞中呈現(xiàn)差異性：盡管成功的轉(zhuǎn)染可以在單個細(xì)胞里產(chǎn)生非常高的拷貝數(shù)，但不同細(xì)胞間卻有高度的差異性。在一些細(xì)胞中，質(zhì)?？截悢?shù)非常高，而在另外一些細(xì)胞卻是低拷貝甚至沒有。而病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)更傾向于相對均勻地把基因轉(zhuǎn)到細(xì)胞中。

TRE promoter: Tetracycline-responsive element promoter (2nd generation). This element can be regulated by a class of transcription factors (e.g. tTA, rtTA and tTS) whose activities are dependent on tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline).

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

rBG pA: Rabbit beta-globin polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Promoter: The tissue-specific promoter chosen to drive expression of the rtTA protein.

rtTA: Reverse tetracycline responsive transcriptional activator M2 (2nd generation). This protein binds to TRE promoter to activate gene transcription only in the presence of tetracycline or its analogs (e.g. doxycycline). It has higher sensitivity to the inducing drug and lower leaky activity in the absence of the drug compared to its predecessor.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream rtTA protein.

CBh promoter: CMV early enhancer fused to modified chicken β-actin promoter. This drives the expression of the downstream tTS protein.

tTS: Tetracycline-controlled transcriptional silencer. This protein binds to TRE promoter to actively suppress gene transcription only in the absence of tetracycline and its analogs (e.g. doxycycline).

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream tTS protein.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.